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Nature Communications volume 13、記事番号: 4337 (2022) この記事を引用

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この記事に対する出版社の訂正は 2022 年 10 月 13 日に公開されました

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われわれは、(i) 再設計されたウイルス転写制御配列と、(ii) 欠失したオープンリーディングフレーム (ORF) 3、6、7、および 8 (Δ3678) を備えた弱毒化生 SARS-CoV-2 ワクチン候補を報告する。 Δ3678 ウイルスは、ヒト気道初代培養細胞では野生型 SARS-CoV-2 よりも約 7,500 倍低い複製ですが、ワクチン製造が承認されているインターフェロン欠損 Vero-E6 細胞では複製を回復します。 Δ3678 ウイルスは、ハムスターモデルと K18-hACE2 マウスモデルの両方で高度に弱毒化されています。 Δ3678 ウイルスを 1 回免疫すると、ハムスターが野生型ウイルスの感染や感染から保護されます。 Δ3678 ウイルスの欠失した ORF の中で、ORF3a は、I 型インターフェロンシグナル伝達中の STAT1 リン酸化の拮抗による最も多くの減衰の原因となります。また、ハイスループットの中和および抗ウイルス試験用に、mNeonGreen レポーター Δ3678 ウイルスも開発しました。まとめると、結果は、Δ3678 SARS-CoV-2 が弱毒化生ワクチン候補として、また潜在的なバイオセーフティーレベル 2 の使用のための研究ツールとして機能する可能性があることを示唆しています。

SARS-CoV-2 によって引き起こされた新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックは、5 億 1,300 万人以上の感染者と 620 万人以上の死亡者をもたらしました（2022 年 5 月 1 日時点; https://coronavirus.jhu.edu/）。新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) に対しては、mRNA、ウイルスベクター、サブユニットタンパク質、不活化ウイルスなど、さまざまなワクチンプラットフォームの開発に成功しています。 SARS-CoV-2 の弱毒化生ワクチンは、低コスト、強力な免疫原性、潜在的に長い免疫持続性という利点があるにもかかわらず、積極的に研究されていません 1。 SARS-CoV-2 ビリオンは、ヌクレオカプシド (N) タンパク質で覆われたゲノム RNA によって形成される内部ヌクレオカプシドと、スパイク (S)、膜 (M) が埋め込まれた細胞由来の二重脂質膜によって形成される外部エンベロープで構成されます。、およびエンベロープ (E) タンパク質 2。プラスセンスの一本鎖ウイルス RNA ゲノムは、複製機構を形成する 16 個の非構造タンパク質 (ORF1a/ORF1b)、4 つの構造タンパク質 (S、E、M、および N) のオープンリーディングフレーム (ORF) をコードしています。 7つのアクセサリータンパク質3. SARS-CoV-2 アクセサリータンパク質の正確な機能はまだ解明されていないが、他のコロナウイルスに関する以前の研究では、これらのタンパク質はウイルス複製に必須ではないが、宿主経路との相互作用を通じて複製と病因を調節できることが示唆されている4、5、6、7。 8. したがって、アクセサリータンパク質の欠失は、SARS-CoV-2を弱毒化するために使用できる可能性がある。

コロナウイルスは、転写調節配列 (TRS) によって媒介される不連続な転写機構を介してサブゲノム RNA (sgRNA) を複製し、転写します。 TRSは、ゲノムの5'末端付近および下流ORFの5'末端に位置する保存されたヌクレオチド配列です（図1a）。これらの TRS は、リーダー TRS とボディ TRS の間の塩基対形成を介して転写を制御し、sgRNA の生成につながり、下流の ORF を翻訳します9、10、11。 TRS 内では、6 ～ 8 ヌクレオチドのコア配列が、新生 RNA とリーダー TRS の間の塩基対形成をガイドします。 SARS-CoV TRSネットワークのガイド配列を再配線すると、弱毒化されたウイルスが生成される可能性があることが以前に示されている。このような TRS 変異型 SARS-CoV は、復帰のリスクを最小限に抑えるための弱毒生ワクチンアプローチとして機能する可能性があります 12,13。

Δ678 および Δ3678 SARS-CoV-2 の構築のスキーム図。欠失はUSA-WA1/2020株の骨格に導入された。緑色と赤色のボックスは、それぞれ元の TRS 配列と変異した TRS 配列を示します。 T7 T7プロモーター、Lリーダー配列、TRS転写調節配列； ORFオープンリーディングフレーム、Eエンベロープ糖タンパク質遺伝子、M膜糖タンパク質遺伝子、Nヌクレオカプシド遺伝子、UTR非翻訳領域、pAポリAテール。 b 組換え WT、Δ678、および Δ3678 ウイルスのプラーク形態。プラークアッセイを Vero-E6 細胞で実施し、感染後 2.5 日目に染色しました。 c – e Vero-E6（c）、Calu-3（d）、およびHAE（e）細胞上のWT、Δ678、およびΔ3678 SARS-CoV-2の複製動態。 WT、Δ678、およびΔ3678 ウイルスを、それぞれ 0.01、0.1、および 2 の MOI で Vero-E6、Calu-3、および HAE 細胞に接種しました。 2時間のインキュベーション後、細胞をDPBSで3回洗浄し、新鮮な2% FBS DMEM下で継続的に培養した。 Vero-E6 細胞のプラークアッセイを使用して、培養上清の感染ウイルス力価を測定しました。 f 感染後7日目のHAE細胞におけるWT、Δ678、およびΔ3678 RNAの細胞内レベル。 HAE 細胞を PDBS で 3 回洗浄し、RNA を単離するために Trizol で溶解し、RT-qPCR を使用してウイルス RNA を定量しました。 c〜f ドットは、個々の生物学的複製を表します（Vero-E6およびCalu-3の場合はn = 3、HAEの場合はn = 5）。グラフ内の値は平均値±標準偏差を表します。対応のない両側 t 検定を使用して、WT グループと Δ678/Δ3678 グループ間の有意差を決定しました。 P 値は、多重比較を考慮してボンフェローニ補正を使用して調整されました。 p < 0.025の場合、差は有意であるとみなされました。 g MOI 0.5でmNG WTまたはmNG Δ3678ウイルスを感染させた後のmNG陽性HAE細胞。 3 つの独立した実験からの mNG 陽性細胞の代表的な画像を示します。 mNG 陽性画像の解像度が低いのは、HAE 培養物が 6 ウェルプレートに配置されたプラスチックインサート上の多層生細胞で構成されていたためです。スケールバー、100 μm。 c–f ソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。

660 (day 2) and >80 folds (day 2), respectively; no infectious viruses were detected in trachea (Fig. 3e) and lungs (Fig. 3f) from the immunized groups. The challenge significantly increased the neutralization titers (on day 21 post-challenge) in both the ∆3678- and WT virus-immunized groups (Fig. 3g), suggesting that a single infection with the ∆3678 or WT virus did not elicit sterilizing immunity. Histopathology analysis showed that immunization with attenuated ∆3678 virus reduced lung pathology score, inflammation, alveolar septa change, and airway damage (Supplementary Fig. 2). In contrast, previous infection with WT virus did not exhibit improved lung histopathology after the challenge, possibly because the observed pathologic changes were caused by the initial WT viral infection (Supplementary Fig. 2). Collectively, the results demonstrate that immunization with attenuated ∆3678 virus can protect against WT SARS-CoV-2 challenge in hamsters./p>5.6 × 106 PFU/ml on interferon-incompetent Vero-E6 cells (Fig. 1c), making large-scale production feasible in this vaccine manufacture-approved cell line or its derivative Vero-E6-TMPRSS2 cells. In contrast, the ∆3678 virus was highly attenuated when infecting immune-competent cells, as evidenced by the 7500-fold reduction in viral replication of WT virus on human primary HAE cells (Fig. 1e). In both hamster and K18-hACE2 mouse models, the ∆3678 infections did not cause significant weight loss or death at the highest tested infection dose [106 PFU for hamsters (Fig. 2b) and 4 × 104 PFU for K18-hACE2 mice (Fig. 4c, g)], whereas the WT virus caused weight loss and death at a much lower infection dose (>4 × 102 PFU for K18-hACE2 mice; Fig. 4b, f). Analysis of individual ORF deletion viruses identified ORF3a as a major accessory protein responsible for the attenuation of the ∆3678 virus (Fig. 5b); this conclusion was further supported by the observation that the addition of ∆3a to the ∆678 virus significantly increased the attenuation of ∆3678 replication (Fig. 1c–f). Our results are supported by a recent study reporting that ∆3a SARS-CoV-2 and, to a less extend, ∆6 SARS-CoV-2 were attenuated in the K18-hACE2 mice34. Mechanistically, we found that ORF3a protein antagonized the innate immune response by blocking STAT1 phosphorylation during type-I interferon signaling. Thus, the deletion of ORF3a conferred SARS-CoV-2 more susceptible to type-I interferon suppression. Our results are supported by previous reports that expression of SARS-CoV-2 ORF3a alone antagonized type-I interferon signaling19,35. The ORF3a protein was recently shown to form a dimer in the cell membrane with an ion channel activity36, which may account for its role in cell membrane rearrangement, inflammasome activation, and apoptosis37,38,39. Whether the ion channel activity of ORF3a is required for the inhibition of STAT1 phosphorylation remains to be determined./p>